如何进行AAV病毒包装？

AAV（腺相关病毒）包装是将目标基因插入AAV病毒颗粒中的过程，通常用于基因治疗。下面是AAV病毒包装的具体步骤：

1. 构建质粒

• 表达质粒：载有目标基因（转基因）并包含AAV的反向末端重复序列（ITRs），这些序列对于包装病毒基因组至关重要。
• 辅助质粒：包含病毒的复制（Rep）和衣壳（Cap）基因，用于生成AAV病毒的结构和复制过程。
• 辅助病毒质粒：通常提供腺病毒的辅助基因，如E2A、E4、VA，这些基因促进病毒颗粒的生成。

2. 细胞转染

• 常用的包装细胞系为HEK293细胞，因为它们表达腺病毒的E1基因，能够帮助AAV的包装和生产。
• 使用质粒混合物，包括表达质粒、辅助质粒和腺病毒辅助质粒，通过化学转染试剂（如PEI、Lipofectamine）或电穿孔将质粒共同转染至HEK293细胞中。

3. 病毒生产

• 转染后，细胞内会开始组装AAV病毒颗粒。通常，转染后48-72小时病毒达到高峰。
• 可以收集细胞培养上清液或裂解细胞以释放病毒颗粒。

4. 病毒纯化

AAV病毒包装完成后，需要进行纯化。常见的纯化方法包括：

• PEG沉淀法：使用聚乙二醇（PEG）沉淀AAV颗粒。
• 梯度离心法：使用氯化铯（CsCl）或碘克糖梯度离心，分离病毒颗粒。
• 层析法：利用离子交换层析或亲和层析柱进行高效纯化。

5. 滴度测定

纯化后的病毒需要进行滴度测定，以确定其浓度和效力。常用的滴度测定方法包括：

• qPCR法：检测病毒基因组拷贝数。
• ELISA法：检测AAV衣壳蛋白。
• 感染实验法：将病毒感染细胞，观察目标基因的表达量。

6. 病毒储存

纯化后的AAV病毒通常储存在-80°C的条件下，以保持其稳定性和活性。

关键点：

• 优化转染效率和细胞培养条件可以提高病毒的产量。
• 纯化过程中避免破坏病毒颗粒是成功包装的关键。